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Fréquence des virus pharmacorésistants et de l’excrétion virale chez les patients atteints d’influenza pédiatrique traités par des inhibiteurs de la neuraminidase

Tuesday, May 1st, 2018 | Alain | Transplantation

Voir le commentaire de Dolan sur les pages – Contexte Bien que la résistance du virus de la grippe à l’inhibiteur de la neuraminidase, le zanamivir, soit moins fréquente que la résistance à l’oseltamivir, un inhibiteur de la neuraminidase, on ne sait pas si cette différence est due au Nous avons donc comparé la prévalence des virus pharmacorésistants et de l’excrétion du virus chez des enfants infectés par le virus de la grippe saisonnière traités par l’oseltamivir ou le zanamivir. Méthodes Des échantillons cliniques de gorge ou d’écouvillonnage nasal ont été prélevés chez un total de patients grippaux pédiatriques. Saisons de la grippe Des mutants résistants aux inhibiteurs de la neuraminidase ont été détectés parmi les virus isolés en séquençant les gènes de l’hémagglutinine et de la neuraminidase virale. La sensibilité des virus aux inhibiteurs de la neuraminidase a été testée par inhibition de la neuraminidase. Chez les patients traités par le zanamivir, la période d’excrétion du virus était significativement plus courte que chez les patients traités par l’oseltamivir. En outre, la fréquence des virus résistants au zanamivir a été significativement plus faible. Comparaison avec le traitement par oseltamivir, le traitement des patients pédiatriques par le zanamivir a entraîné l’émergence de moins de virus grippaux pharmacorésistants et une période d’excrétion virale plus courte. Nous concluons que le zanamivir est prometteur thérapie pour les patients de la grippe pédiatriques

Voir le commentaire éditorial de Dolan – La grippe saisonnière impose une charge de morbidité importante, en particulier aux populations à haut risque – populations pédiatriques, gériatriques et immunodéprimées, entre autres – qui supportent une part substantielle de la morbidité et de la mortalité de la maladie le développement du zanamivir et de l’oseltamivir, inhibiteurs de la neuraminidase NA des virus grippaux, a fourni des traitements médicamenteux améliorés pour traiter les patients grippaux Les efficacités de ces inhibiteurs NA étaient comparables Cependant, l’oseltamivir, médicament oral, Le zanamivir, un médicament inhaléL’émergence de virus grippaux pharmacorésistants est une préoccupation majeure lorsque des traitements antiviraux sont utilisés, car ces virus annulent les médicaments, comme l’illustre le cas du virus de la grippe saisonnière HN récemment apparu . de virus grippaux pharmacorésistants est plus faible chez les adultes que chez les enfants chez qui l’immunité limitée à ces virus l’émergence de virus pharmacorésistants chez les enfants affecte non seulement les patients individuels, mais aussi la santé publique. Les virus résistants aux inhibiteurs de NA émergent moins fréquemment ceux résistants aux inhibiteurs des canaux ioniques M amantadine et rimantadine , qui ont été utilisés pour le traitement des patients grippaux pendant plus de décennies Bien qu’une seule substitution d’acide aminé à la position,,,,, ou dans le NA N système de numérotation confère une résistance aux virus contre l’oseltamivir et / ou le zanamivir [,,, -], les virus possédant ces substitutions ont été atténués et pensaient ne pas causer d’épidémies [, -] Des études ont révélé une plus grande proportion de virus résistants à l’oseltamivir. patients traités par oseltamivir que ce qui était initialement prévu , ainsi que la transmission interhumaine de virus grippaux B résistants à l’oseltamivir Fur Des virus humains HN résistants à l’oseltamivir qui transmettent efficacement chez l’homme sont apparus en Europe pendant la saison grippale , se sont propagés à l’échelle mondiale et circulent actuellement sans pression sélective de composés antiviraux Récemment, l’efficacité de l’oseltamivir a diminué Chez les patients pédiatriques atteints de la grippe infectés par des virus résistants à l’oseltamivir Les substitutions d’acides aminés dans l’hémagglutinine HA diminuent également la sensibilité des virus aux inhibiteurs NA Bien que pendant la saison grippale au Japon, environ Les virus HN ou de type B, possédaient la mutation NA résistante à l’oseltamivir connue à la position, aucun virus résistant n’a été trouvé pendant la saison En saison,% -% des virus HN, qui circulaient principalement au Japon, présentaient une résistance à l’oseltamivir [ -], comparé au% de résistance à l’oseltamivir parmi les virus HN isolés en Norvège en novembre de Cependant, Matsuzaki et al ont montré que tous Les virus HN isolés et testés au Japon durant la saison étaient résistants à l’oseltamivir , alors qu’aucun virus HN ou B de type B résistant à l’oseltamivir n’a été signalé. Bien que de nombreux virus résistants à l’oseltamivir aient été isolés dans le monde, les isolats cliniques sont assez limités. , si cela est dû à l’utilisation limitée de zanamivir ou à une propriété de la drogue est inconnue Nous avons étudié la fréquence des virus pharmacorésistants chez les enfants infectés par le virus de la grippe saisonnière traités par oseltamivir ou zanamivir, en recueillant des échantillons cliniques pendant le Saisons de la grippe, et, – et les analyser pour la présence de virus pharmacorésistants Nos résultats indiquent que le zanamivir est supérieur à l’oseltamivir en ce qui concerne l’émergence de virus pharmacorésistants pendant la thérapie. En outre, nous avons révélé que l’utilisation du zanamivir diminue la période d’excrétion du virus par rapport à l’utilisation de l’oseltamivir

Méthodes

Patients et échantillons

Tous les patients ont été testés positifs à la grippe en utilisant le kit de diagnostic rapide de la grippe ESPLINE Influenza A & amp; B-N Fujirebio Spécimens cliniques gorge ou écouvillon nasal prélevés chez un total de patients pédiatriques ayant consulté le service de pédiatrie dans les hôpitaux de l’hôpital Eiju, Tokyo; L’hôpital Keiyu et les cliniques pour enfants Zama et Ichikawa, Kanagawa au Japon pendant les saisons de grippe, -, – et – ont été soumis à des analyses virologiques Tous les patients ont été traités par oseltamivir mg / kg par jour en doses divisées deux fois par jour pendant plusieurs jours. zanamivir mg par jour en doses fractionnées deux fois par jour pendant plusieurs jours, début h ou moins après l’apparition des symptômes Le choix des inhibiteurs NA était basé sur les souhaits des patients ou des parents ou sur les manifestations cliniques des patients, par exemple vomissements ou respiration sifflante. Aucun de ces patients n’était immunodéprimé, recevait des corticostéroïdes ou des immunosuppresseurs, ou avait un facteur de risque contre-indiquant l’utilisation de l’oseltamivir ou du zanamivir. Tous les patients enrôlés sans hospitalisationNous avons prélevé des échantillons cliniques de chaque patient à des moments précis: à la première visite avant l’administration du médicament et le jour – et / ou le jour – après le début du traitement En ce qui concerne l’oseltamivir, les échantillons «deuxième» et «deuxième ou troisième» ont été prélevés le jour et le jour. Les patients traités avec le zanamivir ont reçu des échantillons «deuxième» et «deuxième ou troisième» jour et jour respectivement. Le consentement éclairé oral a été obtenu des parents de tous les patients. Notre protocole de recherche a été approuvé par le comité d’éthique de chaque hôpital et par le Comité de révision de l’éthique de la recherche de l’Institut des sciences médicales de l’Université de Tokyo.

Isolement viral et séquençage du génome viral

Le sous-type HA des virus dans les échantillons a été déterminé au moyen d’un test d’inhibition HA classique. L’ARN viral a été extrait directement des échantillons collectés avec le QIAamp Viral Mini kit QIAGEN et transcrit par reverse reverse avec la transcriptase inverse SuperScript III Invitrogen selon les instructions du fabricant. Nous avons cloné les produits de PCR dans le vecteur pCR-Blunt II-TOPO Invitrogen et déterminé que les produits ont été clonés dans le vecteur pCR-Blunt II-TOPO Invitrogen. La séquence nucléotidique des amorces utilisées pour la transcription inverse, la PCR et le séquençage du génome viral est disponible sur demande. Les spécimens ont également été prélevés sur la séquence nucléotidique des gènes HA et NA d’au moins deux clones de chaque échantillon avec ABI PRISM et xl Genetic Analyzer Applied Biosystems. soumis à l’isolement du virus et à la titration chez un enfant canin de Madin-Darby Les cellules de Ney, qui ont été maintenues dans le milieu essentiel minimal d’Eagle supplémenté de% de sérum de veau nouveau-né Sigma et cultivées à ° C en% de CO Pour le test d’inhibition de la neuraminidase voir ci-dessous, des virus purifiés sur plaque ont été utilisés.

Neuraminidase Inhibition Assay

La sensibilité des virus grippaux aux inhibiteurs de NA a été évaluée par un test d’inhibition de la neuraminidase en utilisant l’acide ‘–méthylumbelliféryl-α-d-N-acétylneuraminique MUNANA; Sigma comme substrat fluorescent Nous avons incubé μL de virus dilués contenant des unités de fluorescence de MUNANA à ° C pendant min avec un volume égal nM à mM de l’inhibiteur de NA oseltamivir carboxylate la forme active de l’oseltamivir; Roche Products ou zanamivir GlaxoSmithKline dans du tampon MES-mM mM – acide [N-morpholino] éthanesulfonique, CaCl mM; On a ensuite ajouté le μL de MUNANA mM aux mélanges, suivi d’une incubation supplémentaire à ° C pendant min. On a stoppé la réaction virale NA-MUNANA en ajoutant μL de NaOH M en% éthanol pH, et on a mesuré la fluorescence à une longueur d’onde d’excitation nm et une longueur d’onde d’émission de nm La concentration médiane inhibitrice IC des inhibiteurs de NA a été déterminée en extrapolant la relation entre la concentration de l’inhibiteur et le pourcentage d’inhibition de la fluorescence

Analyse phylogénétique

Toutes les séquences ont été assemblées et éditées à l’aide du logiciel BioEdit. L’analyse phylogénétique a été réalisée avec la méthode de jointure voisine en utilisant le modèle de substitution des nucléotides de Kimura -parameter dans Logiciel MEGA Les valeurs bootstrap ont été calculées à partir de réplicats Les arbres ont été enracinés respectivement dans A / New Caledonia // HN et A / Wyoming // HN pour les virus HN et HN

Analyses statistiques

Les données de base avant l’administration du médicament ont été comparées aux données appariées en utilisant le test χtest ou Fisher exact pour les variables catégoriques. Pour comparer les données avant et après l’administration du médicament, le χtest a été utilisé pour le taux d’isolement du virus et le test exact de Fisher a été utilisé. fréquence Les analyses ont été effectuées à l’aide de SPSS J SPSS pour les valeurs Windows P de & lt; ont été considérés comme statistiquement significatifs

RÉSULTATS

Information sur le patient

Nous avons traité des patients grippaux pédiatriques, avec de l’oseltamivir et avec du zanamivir. Tous les patients enrôlés présentaient une température de fièvre, & gt; ° C pour & lt; Il n’existait pas de différence statistiquement significative entre les groupes de patients traités par oseltamivir et zanamivir en termes de type ou de sous-type d’isolats de virus, de distribution par âge, de sexe, d’antécédents de vaccination et de Tableau supplémentaire S, ou cours clinique supplémentaire Tableau S, à l’exception de la température corporelle lors de la première visite: la température corporelle moyenne des patients traités par le zanamivir était significativement plus élevée que celle des patients traités par oseltamivir.

Tableau Caractéristiques des patients atteints d’influenza pédiatrique étudiés Paramètre Patients traités par oseltamivirn = Patients traités par zanamivirn = P Type ou sous-type de virus isolés chez les patients HN HN Type B Âge, années Moyenne ± écart-type ± Échelle – – Sexe, non-mâle / non-femelle / / Non% de patients ayant un antécédent de vaccination Paramètre Patients traités par oseltamivirn = Patients traités par zanamivirn = P Type ou sous-type de virus isolés chez les patients HN HN Type B Âge, années Moyenne ± écart-type ± écart – – Sexe, aucun homme / aucune femme / / Non% de patients ayant un antécédent de vaccination View Large

Effet des inhibiteurs de NA sur la période de propagation du virus

Nous avons d’abord comparé l’effet des inhibiteurs de NA sur la période d’excrétion virale. Tableau complémentaire S Les virus grippaux ont été isolés à partir de% d’échantillons et de% d’échantillons prélevés le jour – chez les patients traités respectivement par oseltamivir et zanamivir, considérant que le% d’échantillons et le% d’échantillons des échantillons prélevés le jour – respectivement chez les patients traités à l’oseltamivir et au zanamivir contenaient des virus infectieux Bien qu’aucune différence statistiquement significative n’ait été trouvée dans le taux d’isolement du virus lorsque les spécimens étaient collectés le jour de l’oseltamivir Les patients traités et traités par le zanamivir ont été comparés, le taux d’isolement du virus des échantillons prélevés le jour était significativement plus élevé dans le groupe traité par oseltamivir que dans le groupe traité au zanamivir. P = Ces résultats suggèrent que le zanamivir diminue l’excrétion virale et donc raccourcit la période d’excrétion du virus plus efficacement que l’oseltamivir

Fréquence des virus pharmacorésistants

Pour détecter une mutation des acides aminés qui confère la résistance aux virus, nous avons séquencé le gène NA viral dans tous les échantillons prélevés chez tous les patients enrôlés. En comparant les séquences d’acides aminés déduites avant l’administration du médicament, nous n’avons trouvé aucun résultat. acides aminés connus pour conférer une résistance aux inhibiteurs NA aux virus, avec ceux obtenus plus tard, nous avons détecté des substitutions NA dans des échantillons prélevés chez des patients traités par oseltamivir% Table En ce qui concerne les séquences d’acides aminés de HA obtenues uniquement pour les virus possédant des substitutions NA , aucune différence n’a été détectée entre les virus isolés avant ou après le traitement médicamenteux

Tableau récapitulatif des virus grippaux possédant une neuraminidase NA Substitution ID de virus Substitution d’acides aminés dans NA Sous-type de virus Âge du patient, années Date du prélèvement après le début du traitement Proportion de virus avec NA substitué,% a IC pour oseltamivir, b nM Virus parental Virus mutant ArgLys HN,, ArgLys HN NTc NT NTc NT ArgLys HN NT NT HisTyr HN HisTyr HN TS NT GluVal HN Virus ID Substitution d’acide aminé dans NA Sous-type de virus Âge du patient, années Date du jour d’échantillonnage après le début du traitement Proportion de virus avec NA substitué,% un IC pour l’oseltamivir, b nM Virus parental Mutant virus ArgLys HN,, ArgLys HN NTc NT NTc NT ArgLys HN NT NT HisTyr HN HisTyr HN NT NT GluVal HN aPour chaque isolat de virus, nous analysé les séquences nucléotidiques des gènes NA des clones moléculaires au moins et calculé la proportion de clones d’ADNc codant pour les valeurs inhibitrices NAsbMedian inhibiteurs de concentration sont la moyenne des réactions dupliquéesNT indique des échantillons non testés parce que les virus infectieux ne sont pas isolés des spécimens correspondantsVoir grand parmi les NA avec une substitution, N NA possédait une substitution arginine-lysine à la position ArgLys, N NA possédait une substitution acide glutamique-valine à la position GluVal, et N NA possédait une substitution histidine-tyrosine à la position HisTyr, tous Sur la base d’analyses de séquences de plus de clones moléculaires du gène NA pour chaque échantillon, les proportions de virus possédant les AN résistantes aux médicaments étaient de% ou moins dans tous les cas. spécimens testés, à l’exception de l’échantillon prélevé le jour, dans lequel% des gènes NA clonés codaient pour un mutant HisTyr Tableau Pour évaluer la sensibilité à l’oseltamivir des virus possédant les NA substitués NA ArgLys, NA GluVal et NA HisTyr, nous avons effectué un test d’inhibition de la neuraminidase en utilisant des plaques purifiées. Les CI de l’oseltamivir des virus possédant ArgLys, GluVal et HisTyr dans NA étaient environ, -, -, et -fold plus élevés que ceux de leurs virus parents, respectivement. Nous avons également testé la sensibilité à l’oseltamivir des isolats prélevés au hasard Les virus HN, HN ou de type B isolés à partir de patients traités par oseltamivir pendant les saisons grippales -, -, et -; le CI pour l’oseltamivir de ces virus sans la mutation NA résistante était beaucoup plus faible que celui des virus résistants à l’oseltamivir représentatifs Ces résultats confirment que les AN mutantes confèrent effectivement une résistance substantielle aux virus contre l’oseltamivir, ce qui est cohérent avec les rapports précédents [,, ,] Analyse phylogénétique du gène NA des virus HN a révélé que les ID virus viraux résistants et détectés dans cette étude sont classés dans des clades distincts Figure supplémentaire A, comme indiqué précédemment Virus ID est tombé dans le clade, qui est le clade de la plupart des virus de la saison En revanche, le virus ID est tombé au sein du clade, qui comprend un virus A / Brisbane // – like la souche vaccinale pour les – et – saisons Les virus HN saisonniers actuellement résistants à l’oseltamivir circulant sont également classés dans ce clade plus de% des virus HN saisonniers en circulation après la saison grippale sont résistants à l’oseltamivir, la plupart des virus HN saisonniers Parmi les virus HN résistants à l’oseltamivir détectés dans cette étude, il a été montré que le virus ID était un virus de type A / California // la souche vaccinale pour la saison par analyse phylogénétique du gène NA pour les virus HN Figure A Bien que les deux virus identifient et soient classés comme virus A / Wisconsin // – la souche vaccinale pour la saison, ils n’étaient pas étroitement apparentés. Le virus ID est tombé en tant qu’intermédiaire entre ces souches vaccinales. Ces résultats suggèrent que l ‘oseltamivir est résistant. Contrairement au groupe traité par l’oseltamivir, aucune substitution NA n’a été détectée chez les virus isolés chez les patients traités par le zanamivir. Ces résultats révèlent que la fréquence des virus résistants au zanamivir est faible. significativement plus faible que la fréquence de ceux résistants à l’oseltamivir

DISCUSSION

Dans cette étude, des échantillons cliniques ont été prélevés sur des groupes statistiquement similaires de patients grippaux pédiatriques, l’un traité par oseltamivir et l’autre par zanamivir. Tableau Nous avons ensuite comparé la fréquence des virus grippaux saisonniers résistants à l’oseltamivir ou au zanamivir chez ces patients. présente un avantage substantiel par rapport à l’oseltamivir en ce qui concerne l’émergence de virus résistants chez les enfants. En outre, nous avons constaté que le zanamivir raccourcissait significativement la période d’excrétion virale comparativement à l’oseltamivir. Des résultats similaires ont été observés pour le zanamivir contre le HN, mais pas étude antérieure , bien que les résultats ne soient pas statistiquement significatifs Nos données confirment les résultats précédents et suggèrent que le zanamivir pourrait être un agent thérapeutique supérieur chez les patients pédiatriques pouvant être traités par des médicaments inhalésLes virus résistants à l’oseltamivir ne semblent pas causer de virus prolongés ou prolongés élimination de la table supplémentaire Tableau S et S supplémentaires, bien que nous n’ayons pas trouvé de différence statistiquement significative entre les virus sensibles à l’oseltamivir et ceux résistants à l’oseltamivir en raison du nombre limité de cas d’infection virale résistante. Les jeunes enfants sont immunologiquement immatures comparés avec des adultes, permettant une réplication virale plus persistante – une dynamique qui peut être reflétée par une infection prolongée et prolongée des jeunes enfants pendant une pandémie de grippe La fréquence des virus résistants à l’oseltamivir dans cette étude était de% des patients traités par oseltamivir. comparables à ceux d’études précédentes indiquant une fréquence plus élevée de virus résistants à l’oseltamivir chez les enfants que chez les adultes Pris ensemble, les variants résistants à l’oseltamivir peuvent apparaître plus fréquemment dans une situation pandémique où la majorité des patients sont immunologiquement naïfs au virus En fait, la pandémie d’origine porcine résistante à l’oseltamivir HN vir Des études ont révélé que le zanamivir est efficace contre les isolats résistants à l’oseltamivir in vitro [,, En outre, l’efficacité du zanamivir est comparable à celle de l’oseltamivir dans les populations pédiatriques et adultes . Par conséquent, le zanamivir pourrait jouer un rôle important dans le traitement de la grippe. Susan Watson pour l’édition de ce manuscrit partie, par Subventions pour la recherche spécialement promue et pour la recherche scientifique, par un fonds de recherche sous contrat pour le programme des centres de recherche fondateurs pour les maladies infectieuses émergentes et réémergentes, par l’Agence japonaise pour la science et la technologie ERATO Promouvoir la science et la technologie du Ministère de l’éducation, de la culture, des sports, de la science et de la technologie du Japon et par nation Institut de l’Allergie et des Maladies infectieuses Subventions de recherche du Service de santé publique, États-Unis Conflits d’intérêts potentiels YK a reçu des honoraires de Chugai Pharmaceuticals, Novartis, Diichi-Sankyo, Toyama Chemical, Wyeth et GlaxoSmithKline; accorder un soutien à Chugai Pharmaceuticals, à Daiichi Sankyo Pharmaceutical et à Toyama Chemical; est un consultant pour Theraclone; et est un fondateur de FluGen NS a reçu des honoraires de conférencier de Chugai Pharmaceuticals, Diichi-Sankyo et Takeda Tous les autres auteurs ne signalent aucun conflit potentiel