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Transmission sélective des quasi-espèces de virus de l’hépatite C par un accident de piqûre d’aiguille dans la résolution de l’hépatite aiguë

Contexte Pour montrer comment les quasi-espèces du VHC sont transmises et s’adaptent au nouvel hôte dans une infection résolutive aiguë, nous avons analysé les séquences nucléotidiques et déduites des acides aminés de la région hypervariable HVR. – Dans le domaine E du VHC, à la fois la source du virus «donneur» et la personne qui a reçu le virus par un «destinataire» d’accident par piqûre d’aiguille. Nous avons également effectué une analyse phylogénétique des quasi-espèces du VHC chez ces patients. transmissionResults Nous avons obtenu un total de clones à différents moments en utilisant l’amplification par amplification en chaîne par polymérase et le clonage et le séquençage de HVR- Un variant HVR prédominant d’isolats chez le donneur n’était pas présent chez le receveur et des semaines après l’accident. la variante mineure des isolats chez le donneur est devenue la souche prédominante dans les semaines Les analyses phylogénétiques supplémentaires ont montré une forte homologie des séquences nucléotidiques entre les isolats obtenus du donneur et les isolats obtenus du receveur. En outre, les variants du virus du receveur ont montré une conservation génétique substantielle au cours de la résection aiguë de l’hépatiteConclusions. Les données suggèrent qu’une variante mineure du VHC d’un donneur a été transmise au receveur par une blessure par piqûre d’aiguille et qu’elle a prédominé comme espèce dominante. L’homogénéité génétique préservée des variants viraux transmis chez les patients infectés par le VHC peut expliquer leurs résultats cliniques de résolution. hépatite

Le virus de l’hépatite C est un problème de santé global Environ un% des personnes infectées développent une hépatite chronique après une infection aiguë au VHC , qui est une cause importante de cirrhose du foie et de carcinome hépatocellulaire dans le monde Par manque d’exonucléase l’activité par l’ARN polymérase , le VHC est caractérisé par une hétérogénéité génétique et, par conséquent, peut échapper à l’immunité immunitaire Comme le VIH, l’hétérogénéité génétique du VHC n’est pas uniforme dans tout le génome. En revanche, la première région hypervariable HVR- dans l’extrémité N-terminale du domaine E / NS est la plus variable Des études ont montré que HVR- peut servir d’épitopes de cellules B ou T , et génétique l’hypervariabilité est déterminée par la pression immunitaire de l’hôte. Par conséquent, le VHC circule dans des populations génétiquement proches appelées «quasi espèces» chez des individus infectés. La transmission du VHC après un seul accident par piqûre d’aiguille chez le personnel médical varie de% à% Pour les personnes nouvellement infectées, la préférence de certaines quasi-espèces de VHC transmises n’est pas bien comprise. Nous avons analysé des échantillons de sérum en série obtenus du receveur pour déterminer l’activité de l’alanine aminotransférase et la présence d’anticorps contre le VHC anti-VHC. la transmission de quasi-espèces de VHC par un accident de piqûre d’aiguille et l’évolution moléculaire dans l’hépatite résolutive aiguë, nous avons analysé les séquences de nucléotides et d’acides aminés de la région HVR des génomes du VHC récupérés du donneur et du receveur

Matériaux et méthodes

Patients Nous avons observé le patient C, le donneur, un homme âgé et un patient. Le receveur, une femme âgée. Le donneur atteint de leucémie myéloïde chronique avait développé une hépatite C chronique par transfusion sanguine. le receveur, un travailleur de la santé, avait subi un test sanguin, qui révélait des résultats normaux aux tests de la fonction hépatique et des résultats négatifs pour l’anti-VHC. Les deux patients étaient négatifs pour l’antigène de surface de l’hépatite B HBsAg; Laboratoire Abbott et laboratoire Abbott anti-VIH, déterminé à l’aide de trousses commerciales Le donneur avait déjà été testé positif à l’anti-VHC avant l’événement Ni le donneur ni le receveur n’avaient d’antécédents de consommation excessive d’alcool, de drogues injectables ou de marqueurs sérologiques suggestifs Les hépatopathies métaboliques, telles que la maladie de Wilson, l’hémochromatose héréditaire ou la déficience en α-antitrypsine, ont été exclues sur la base des données cliniques et de laboratoire. Les données sur l’activité sérique de l’alanine aminotransférase, anti-VHC et quasi-espèces du donneur ont été déterminées. Au moment de l’accident par piqûre d’aiguille, nous avons observé le receveur pour manifestations cliniques, présence d’anti-VHC et présence de quasi-espèces VHC au moment de l’accident de piqûre et hebdomadairement à mensuellement après l’événement durée totale du suivi, Des échantillons de sérum en série ont été prélevés chez le receveur et conservés à – ° C jusqu’à leur utilisation. Dosages sérologiques Des échantillons de sérum ont été analysés La détection qualitative de l’ARN du VHC sérique a été effectuée à l’aide du test d’amplification par RT-PCR de la région non traduite . Les génotypes du VHC ont été identifiés à l’aide du test d’amplification du VHC par le VHC. Les niveaux d’ADNc du VHC sérique ont été quantifiés en utilisant un test PCR compétitif. L’amplification, le clonage et le séquençage du HVR-HVR ont été détectés par RT-PCR, avec des amorces oligonucléotidiques désignées pour le sens externe d’amplification HVR. CAGGACTGCAATTGCTCAATCTA- ‘; antisens externe, ‘-TTGCAGTTTAAGGCAGTCC-‘; sens interne, ‘-CACTGGGGAGTCCTGG- CGGG-‘; et antisens interne, ‘-ATGTGCCAGCTGCCATTGG-‘, comme décrit précédemment Les bases de produits amplifiés; nucléotides – ont été ligaturés aux vecteurs pCR-Script SK puis transformés en cellules compétentes Escherichia coli XL -Blue MRF Stratagène Les ADN plasmidiques ont été extraits de colonies blanches en utilisant le système de purification d’ADN Winwin minipress Promega La présence d’ADN inséré a été confirmée par digestion SacI et BamHI et électrophorèse Les séquences de l’ADN inséré ont été déterminées en utilisant des amorces marquées par fluorescence avec un modèle de séquenceur A; Les conditions de séquençage de Biosystems Applied ont été spécifiées dans le protocole pour les amorces Applied Biosystems Applied Sequencing Kit et ont été utilisées comme amorces de séquençage pour la détection de la diversité génétique HVR et l’analyse des arbres phylogénétiques. La diversité génétique et la relation évolutive du HVR HVR- Les séquences nucléotidiques des génotypes a, b et a ont été obtenues auprès des bases de données GenBank, European Molecular Biology Laboratory et DNA Data Bank of Japan. de séquences sont indiquées dans la figure Un arbre phylogénétique a été construit par des méthodes voisines en utilisant le programme MEGA de Kumar et al sur la base de séquences nucléotidiques de la séquence HVR amplifiée du génome du VHC L’ensemble de données a été rééchantillonné par bootstrap vérifier le soutien aux principales branches de l’arbre

Figure Vue largeDownload slideAnalyse chronologique de la région hypervariable HVR- séquences du virus de l’hépatite C dans le donneur et le receveur effectuées à l’aide de la méthode -paramètre L’arbre phylogénétique est construit à l’aide d’un programme informatique de la méthode voisine. chaque branche principale & gt;% sont montrés Les numéros d’accès GenBank des séquences rapportées sont indiqués dans le phylogramme La barre indique la distance évolutive A, Arbre phylogénétique de HVR-, par séquences nucléotidiques B, Arbre phylogénétique de HVR-, par séquences d’acides aminés déduitesFigure Voir largeTélécharger l’analysePhylogénétique de la région hypervariable HVR- séquences du virus de l’hépatite C chez le donneur et le receveur réalisées en utilisant la méthode -paramètre L’arbre phylogénétique est construit en utilisant un programme informatique de la méthode de jointure voisine. Les numéros d’accès GenBank des séquences rapportées sont e indiqué dans le phylogramme La barre indique la distance évolutive A, l’arbre phylogénétique de HVR-, par les séquences nucléotidiques B, l’arbre phylogénétique de HVR-, par des séquences d’acides aminés déduites

Résultats

Comme le montre la figure, le receveur était asymptomatique jusqu’à des semaines après l’accident de piqûre d’aiguille, quand des nausées et des vomissements se développèrent et l’urine du patient devint colorée en thé. Le niveau sérique d’alanine aminotransférase du receveur était IU / L normal, & lt; IU / L, et la séroconversion de l’anti-HCV a été documentée des semaines après l’événement

Figure Vue largeDownload slideClinique clinique du patient W «receveur» ayant une infection aiguë par le virus de l’hépatite C résolvant le VHC La ligne pointillée indique la limite supérieure de l’activité ALT sérique normale des alanine aminotransférases Les résultats des tests d’anticorps anti-VHC sont présentés ci-dessous valeurs d’index de coupure:, & gt ;; , -; et -, & lt; Figure View largeDownload slideClinique clinique du patient W “receveur”, qui avait une infection aiguë par le virus de l’hépatite C résolvant le VHC La ligne pointillée indique la limite supérieure de l’activité ALT sérique alanine aminotransférase sérique Résultats des tests pour anticorps anti-VHC anti-VHC sont présentés avec les valeurs d’index de coupure suivantes:, & gt ;; , -; et -, & lt; L’analyse du génotype du VHC chez les deux patients a révélé que le génotype était b Le niveau d’ADNc du VHC du donneur était de × copies / mL au moment de l’événement Pour le receveur, le taux d’ADNc du VHC ne pouvait être détecté après l’événement, quand il était × copies / mL La détection de l’ADNc du VHC coïncidait avec le premier pic d’activité alanine aminotransférase niveau alanine aminotransférase, l’ADNc du VHC IU / L était transitoirement indétectable plusieurs semaines après l’événement, lorsque l’activité alanine aminotransférase régressait l’alanine aminotransférase niveau, UI / L Le niveau d’ADNc du VHC a de nouveau été détectable × copies / mL semaines après l’événement, lorsque le deuxième pic de l’activité alanine aminotransférase est survenu niveau alanine aminotransférase, UI / L Après la deuxième attaque, un troisième pic d’activité alanine aminotransférase alanine niveau d’aminotransférase, l’UI / L s’est produite des mois après l’événement Cependant, l’ADNc du VHC était indétectable après le deuxième pic de l’activité de l’alanine aminotransférase. à, indices de coupure élevés d’anti-HCV & gt; [ou] ont été observés Les indices – [ou] ont diminué de mois à et étaient inférieurs à la valeur seuil & lt; [ou -] mois après l’événementNous avons analysé les séquences nucléotidiques de HVR- dans les échantillons sériques obtenus du donneur et du receveur Dix clones D ont été trouvés dans les échantillons du donneur Douze clones R et clones R ont été trouvés dans les échantillons semaines et semaines du receveur après l’accident par piqûre d’aiguille, respectivement la figure deux des clones du donneur étaient les mêmes sérums D- et D- In R, et des clones du receveur avec les mêmes séquences nucléotidiques constituaient les variantes majeures R- à R- et les variantes mineures R- et R-, respectivement dans le sérum R, et des clones du receveur avec les mêmes séquences nucléotidiques constituaient les variantes majeures R- à R- et les variantes mineures R- et R-, respectivement. Il y avait des clones différents mais génétiquement proches dans D, dans R, et dans R Les séquences d’acides aminés déduites dans HVR- de tous les clones sont montrées dans la figure Substitutions synonymes, c.-à-d., Des changements dans les nucléotides sans changements dans les acides aminés ont été trouvés entre D- et D-, D- et D-, R- et R-, et R- et R- La variation génétique des clones de HCV dans les échantillons du donneur était plus grande que celle dans les échantillons du receveur. En outre, nos données n’ont pas montré de séquences identiques de nucléotides ou d’acides aminés de VHC HVR- entre le donneur et le receveur Nous avons donc réalisé une analyse phylogénétique des arbres de la HVR – figure A et figure B pour démêler la relation génétique entre ces quasi espèces de HCV. L’analyse a révélé que les souches VHC des deux patients provenaient du même groupe. Trouvé% et% de similarité dans les séquences de nucléotides et les acides aminés déduits de HVR- entre D- et R-, respectivement En outre, des variants du VHC qui ont été déterminés comme étant différents par l’analyse des séquences nucléotidiques de HVR- ont été bien conservés entre les semaines et semaines après l’accident par piqûre d’aiguille, au cours de laquelle des poussées répétées d’activité hépatique ont eu lieu. Quatre-vingt-cinq pour cent de la séquence HVR-aminoacides des acides aminés dans l’échantillon sérique du receveur R et R a été préservé

Figure Vue grandDownload slide Séquences nucléotidiques des produits d’ADNc clonés dans la région hypervariable du VHC du virus de l’hépatite C HVR-; nucléotides – récupérés du donneur D- à D- au moment de l’accident, le destinataire R- à R- semaines après l’accident, et le destinataire R- à R- semaines après l’accident. La séquence consensus est déterminée par le total des clones provenant à la fois du donneur et du receveur L’astérisque indique la séquence maîtresse dans les échantillons Les séquences nucléotidiques de D- et D-; R- à R- et R- à R-; R-, R- et R-; et R- et R- à R- sont identiques. Vue de la figure grandDownloadprotéger les séquences nucléotidiques des produits d’ADNc clonés dans la région hypervariable du VHC du virus de l’hépatite C HVR-; nucléotides – récupérés du donneur D- à D- au moment de l’accident, le destinataire R- à R- semaines après l’accident, et le destinataire R- à R- semaines après l’accident. La séquence consensus est déterminée par le total des clones provenant à la fois du donneur et du receveur L’astérisque indique la séquence maîtresse dans les échantillons Les séquences nucléotidiques de D- et D-; R- à R- et R- à R-; R-, R- et R-; et R- et R- à R- sont identiques

Figure Vue grandDownload slideDiminution des séquences d’acides aminés des séquences nucléotidiques correspondantes dans la région hypervariable du VHC du virus de l’hépatite C HVR-; les acides aminés récupérés du donneur D- à D- au moment de l’accident, le receveur R- à R- des semaines après l’accident, et le receveur R- à R- des semaines après l’accident. La séquence consensus est déterminée par les clones totaux provenant à la fois du donneur et du receveur L’astérisque indique la séquence maîtresse dans les échantillons Les séquences d’acides aminés déduites de D- à D-; R- à R- et R- à R-; et R- et R- à R- sont identiques. Vue à grande échelle Séquence de séquences d’acides aminés réduites des séquences nucléotidiques correspondantes dans la région hypervariable du VHC du virus de l’hépatite C HVR-; les acides aminés récupérés du donneur D- à D- au moment de l’accident, le receveur R- à R- des semaines après l’accident, et le receveur R- à R- des semaines après l’accident. La séquence consensus est déterminée par les clones totaux provenant à la fois du donneur et du receveur L’astérisque indique la séquence maîtresse dans les échantillons Les séquences d’acides aminés déduites de D- à D-; R- à R- et R- à R-; et R- et R- à R- sont identiques

Discussion

Malgré la découverte du VHC par des méthodes de biologie moléculaire et le séquençage du génome entier, nos connaissances sur ce virus et la nature des réponses immunitaires protectrices restent limitées . Certains chercheurs soutiennent que la réponse immunitaire de l’hôte au VHC est la principale En utilisant l’amplification par PCR et le clonage et le séquençage de la HVR-, nous avons découvert que la variante mineure de la quasi-espèce VHC chez le donneur était transmise au receveur et devenait le facteur déterminant de la persistance virale. variante majeure après transmission Après des poussées répétées d’hépatite, le receveur a finalement éliminé le virus. Cette étude a soulevé d’importantes questions sur les raisons pour lesquelles la variante mineure chez le donneur prédominait chez le receveur et pourquoi la clairance virale se produisait chez le receveur. Les clones de HCV ont été principalement réalisés en utilisant des modèles de chimpanzés, avec des résultats contradictoires Une étude a montré, par comparaison des séquences d’acides aminés dans les clones HVR- de HCV, que la quasi-espèce majeure des inoculums humains était identique à celle du sérum de chimpanzé infecté Un autre rapport a montré que la variante mineure, plutôt que la variante majeure, devenait la variante majeure Chimpanzé infecté ou lignées cellulaires lymphocytaires humaines après transmission Une transmission sélective de quasi-espèces du VHC chez l’homme a été constatée après la réception d’une transfusion sanguine , la transmission de l’infection de la mère au nourrisson , et après une piqûre d’aiguille Comme nous l’avons également confirmé dans notre étude, nous proposons des mécanismes possibles pour expliquer le phénomène: sélection des variants au moment de l’entrée, amplification sélective des variants chez le nouvel hôte et immuno-élimination chez le receveur de la variante majeure du donneur. possible qu’une variante présente un avantage sélectif par rapport à d’autres variants lors de l’entrée virale En cas d’infection par le VIH, les différentes capacités macrophages-tropiques du virus hermine l’efficacité de la réplication dans l’espace sous-muqueux Nous pensons qu’il peut y avoir un tropisme tissulaire différent entre les variants, bien que cela reste à prouver. Deuxièmement, il est possible que plusieurs variantes entrent dans le nouvel hôte, mais seulement de son avantage biologique, est sélectivement amplifié pour devenir la souche dominante Ceci est soutenu par l’homogénéité de la séquence chez les patients atteints d’hémophilie qui ont une séroconversion et qui ont probablement été inoculés avec de multiples variantes du VIH par voie parentérale. avantage relatif de l’amplification en raison de l’absence d’un modèle HCV in vitro Troisièmement, il est possible que, après la transmission, la principale variante du donneur monte une pression immunitaire plus forte que les variantes mineures par des taux de réplication et de mutation différents, entraînant une clairance Cependant, nous n’avons pas pu détecter la virémie du VHC dans l’échantillon de sérum du receveur en utilisant un test PCR sensible. De plus, ni l’hépatite ni la séroconversion n’ont été notées pendant les premières semaines après l’événement, ce qui rend ce mécanisme peu probable. Nos données favorisent donc la transmission sélective et l’amplification des quasi-espèces du VHC chez le receveur. l’étude de Saito et al , notre bénéficiaire a développé une hépatite C résolutive aiguë après l’accident de piqûre d’aiguille Les quasi-espèces HCV de notre étude étaient beaucoup moins génétiquement diverses et complexes que les quasi-espèces dans leur cas particulier, la plupart des quasi espèces VHC Les séquences sériques de R et R ont des séquences homogènes de nucléotides et d’acides aminés. Il est à noter que l’évolution du HVR HVR joue un rôle dans la clairance virale, comme le soutiennent Farci et al et Laskus et al. La stase évolutive relative de HVR- dans la quasi-espèce VHC est associée à une hépatite résolutive aiguë, alors que la complexité évolutive En conclusion, l’importance du rapport est -fold Premièrement, nos données démontrent qu’une quasi-espèce mineure du VHC chez le donneur peut être transmise avec succès à un receveur puis prépondérante chez le nouvel hôte. Deuxièmement, l’analyse évolutive moléculaire du VHC peut aider documenter la transmission virale et pourrait potentiellement prédire les résultats Enfin, la stase évolutive de la HVR- dans la quasi-espèce VHC peut être associée à la résolution de l’infection aiguë par le VHC.

Remerciements

Conflits d’intérêts potentiels Tous les auteurs: pas de conflits